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本制品使用重组禽类成髓纤维病毒逆转录酶(AMV RTase)，从总RNA或者Poly(A)+ RNA合成第一链cDNA的试剂盒，含有cDNA第一链合成所需的所有试剂。AMV RT具有RNA聚合酶活性和RNase H的活性，能够作用于GC含量高，二级结构复杂的RNA。合成的第一链cDNA可广泛应用于第二链合成、杂交、PCR扩增、Real-time PCR反应等。

• RNA样品要避免基因组DNA污染。用于cDNA合成的器具须用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液37℃浸泡12h；
  然后在120℃高压灭菌30min去除残留的DEPC。
  
• 用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌(180℃，60min)或者上述DEPC处理的器具盛装，使用的无菌水须用0.1%DEPC处理后进行高温高压灭菌。建议RNA实验使用的器具、试剂和无菌水专用。
  
• 不必从总RNA中分离Poly(A)+ mRNA，但以Poly(A)+ mRNA为模板可以提高终产物得率和纯度。
  
• 尽管以Oligo dT作引物无需优化，但随机六合引物和RNA的比例对于cDNA合成产物的平均长度非常关键，提高随机六合引物/RNA的比值将导致短链cDNA (500bp)产量升高，而减少此比值则有利于长链cDNA的合成。
  
• 提高反应温度到50℃有利于解决富含GC二级结构的mRNA问题。AMV RT的热稳定性相对于M-MuLV较好，在37～50℃有较高活性。
  
• cDNA产物应置于-20℃保存。
  
• 在进行实验操作时应将酶放置于冰上，待实验结束后于-20℃保存。

• 在冰浴的试管中加入如下反应混合物：
  

  成分		用量
  模板	总RNA	＜5μg
  	Poly(A)+ RNA	＜1μg
  	特异性RNA	＜0.5μg
  引物	Oligo dT (0.5μg/μl)	1μL
  	随机六合引物(0.2μg/μl)
  	序列特异性引物(20pmol)
  RNase-free ddH2O		至11μL

  
  
• 轻轻混匀后离心3~5 s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴30 s，然后离心3~5 s。
  
• 将试管冰浴，再加入如下组分：
  

  成分	用量
  5×Reaction Buffer	4μL
  RNase Inhibitor (40U/μL)	1μL
  dNTP Mix (10mmol/L)	2μL
  AMV Reverse Transcriptase(10U/μL)	2μL

  
  注：若5×Reaction Buffer出现白色结晶，需37℃温浴数分钟至白色结晶完全溶解，震荡混匀。
  
• 轻轻混匀后离心3~5 s。
  
• 在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：
  

  过程	温度	时间
  cDNA合成	42℃	30～60min
  终止反应	85℃	5min

  注：
  
  • 如果使用Oligo dT引物或序列特异性引物，进行42℃，30～60min反应；
    
  • 如果使用随机引物，应先进行25℃，10min反应，然后进行42℃，30～60min反应。
    
  • 处理后，置于冰上放置。

• 反转录引物的选择
  
  • 用于第一链cDNA合成的引物，oligo dT有利于长链cDNA的合成，使用该引物只需42℃进行反转录即可，无需25℃预热。
    
  • 随机引物适合于500bp以下的短链cDNA的合成，所转录的RNA模板无需poly(A)尾，可转录5'端区域。使用该引物前须将引物进行25℃温浴。
    
  • 基因特异性引物主要用于合成特定基因片段长度的cDNA。
• 第一链cDNA合成原理及产物检测
  
  • cDNA的合成是以mRNA为模板，以随机引物或者基因特异性引物或者oligo dT为引物，在反转录酶的催化下从5'→3'合成第一链cDNA。
  
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